在这种困境下，陈其美在上海重整旗鼓。清朝末年，上海是兴旺发达的贸易港口，水陆交通便利，尤其是电信，更是便利。上海又是商务与人文荟集之处，作为新文化的中心，新书报杂志种类繁多。上海的外国租界，享有治外法权，清朝统治者在此无能为力。利用这些有利条件，陈其美大大利用自己性情豪放，交际甚广，长于组织，工于谋略等优势，在上海大刀阔斧地行动起来。正是陈其美在上海的反清活动，为同盟会在长江流域的发展打开了新的局面。因为陈其美在上海有社会基础，熟悉情况，后来委任为同盟会中部总会庶务部长，主持日常工作。
1911年10月10日武昌起义爆发，得知武昌首义的消息后，上海的革命党人开始加紧筹划起义事宜。参与筹备起义的有中国同盟会中部总会、光复会上海支部和上海商团公会三方力量，陈其美、李燮和等人是主要负责人。
11月3日上午11时，起义者率先占领闸北巡警总局。由于大势所趋，驻上海的清朝军警纷纷倒向革命党人。午后2时许，各路敢死队与商团武装数千人拥至西门外斜桥西园举行誓师大会，陈其美等人发表慷慨激昂的演说，宣布上海反清独立。起义军接着向上海县城猛攻，县知事衙门、道台衙门均很快被